近日,中國水稻研究所水稻染色體工程及基因組編輯創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與蘇州大學(xué)黃健課題組合作,創(chuàng)建了一種簡單高效的基因編輯突變體篩選方法。相關(guān)研究成果于4月4日在線發(fā)表于《遺傳學(xué)報(bào)(Journal of Genetics and Genomics)》雜志。
隨著CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用,科研人員需要進(jìn)行大量的突變體篩選工作。目前通常的篩選方法包括對(duì)PCR產(chǎn)物限制性酶切、T7E1酶切、PAGE分析、溶解曲線分析等,這些方法存在著耗時(shí)費(fèi)錢、位點(diǎn)特異或者需要特定儀器等缺點(diǎn)。因此,迫切需要開發(fā)一種簡單高效的篩選方法。
PCR是分子生物實(shí)驗(yàn)的一種常規(guī)技術(shù),主要由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。其中,特異性的引物以及適宜的退火溫度是PCR反應(yīng)能否成功擴(kuò)增的關(guān)鍵因素??蒲腥藛T通過設(shè)計(jì)基因編輯位點(diǎn)特異引物,首先以野生型脫氧核糖核酸(DNA)為模板進(jìn)行一次梯度PCR尋找出特異引物的臨界退火溫度,再在臨界退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選突變體。由于該特異引物不能和突變體DNA嚴(yán)格匹配,導(dǎo)致在臨界退火溫度下突變體中的PCR反應(yīng)不能有效進(jìn)行擴(kuò)增。因此最終只需進(jìn)行一次常規(guī)的PCR反應(yīng),便可以靈敏地檢測出成功編輯的突變體。利用ACT-PCR,研究人員不僅在水稻中快速鑒定出單突變體和多突變體,同時(shí)也在斑馬魚中成功鑒定出突變體,表明ACT-PCR的應(yīng)用不受物種的限制。除用于基因編輯突變體鑒定之外,研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),ACT-PCR還可用于定量計(jì)算在細(xì)胞系中進(jìn)行的基因編輯效率,與常用的PCR產(chǎn)物酶切等方法相比,通過定量ACT-PCR得到的數(shù)據(jù)更為接近于真實(shí)的編輯效率。
該研究得到國家自然科學(xué)基金以及中國農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助。水稻所所華宇峰、王春和蘇州大學(xué)黃健為該論文的共同第一作者,王克劍研究員為通訊作者。(通訊員 陳鎏琰)
文章鏈接:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1673852717300577
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水稻所創(chuàng)建一種簡單高效的基因編輯突變體篩選方法
發(fā)布時(shí)間:2017-04-12
|來源: 中國水稻研究所
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