近日,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所王磊研究員申請的專利“表達發(fā)卡RNA的DNA分子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”獲歐盟發(fā)明專利授權(quán)。該發(fā)明專利為構(gòu)建大規(guī)模的RNA干擾(RNAi)文庫進而創(chuàng)制RNAi突變體庫提供了新的方法體系,為功能基因組學(xué)研究以及重要功能基因的挖掘奠定了基礎(chǔ)。
RNA是單鏈線形分子,只有局部區(qū)域為雙鏈結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)是由于RNA單鏈分子通過自身回折使得互補的堿基對相遇,形成氫鍵結(jié)合而成的,稱為發(fā)卡結(jié)構(gòu)。發(fā)卡RNA 是一種具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA,包括一個由雙鏈RNA構(gòu)成的莖(stem),中間由一個環(huán)(loop)序列分隔,其中的莖可以被DCL類酶(一種核糖核酸內(nèi)切酶)加工成干擾小RNA(siRNA),siRNA使細胞中與其同源的mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因沉默,也就是常說的RNA干擾(RNAi)。目前RNAi技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為遺傳分析強有力的工具,在基因功能分析鑒定方面發(fā)揮越來越大的作用。構(gòu)建大規(guī)模的RNAi文庫進而創(chuàng)制RNAi突變體庫是功能基因組學(xué)研究和重要基因挖掘的重要手段之一, 因此如何利用既簡單經(jīng)濟,又高效的方法構(gòu)建特定物種的RNAi文庫就成為關(guān)鍵問題。
為了解決這一難題,科研人員對發(fā)卡RNA的構(gòu)建方法進行了深入研究,采用了創(chuàng)新性的設(shè)計方案,解決了構(gòu)建過程中的兩個關(guān)鍵的技術(shù)難題。首先是經(jīng)過巧妙的設(shè)計把雙鏈的目的基因連接為封閉的單鏈環(huán)狀DNA;其次是創(chuàng)造性地采用滾環(huán)復(fù)制的方法對其進行擴增,在擴增DNA的同時直接合成具有反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA,創(chuàng)建了一種高效的滾環(huán)復(fù)制介導(dǎo)的發(fā)卡RNA構(gòu)建系統(tǒng)(Rolling circle amplification-Mediated Hairpin RNA, RMHR)。
近年來,王磊研究員課題組在小RNA研究方面取得多項成果,利用RMHR系統(tǒng),已成功地把擬南芥和水稻的cDNA文庫轉(zhuǎn)變成了發(fā)卡RNA文庫(lhRNA library),并獲得了大量的擬南芥和水稻突變體材料,為功能基因組的研究提供了一個新型高效的研究體系和技術(shù)平臺。(通訊員 崔艷)
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