近日,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)與應(yīng)用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校合作,使用RNA作為同源重組修復(fù)(HDR)的模板,并分別利用核酶自切割和具有RNA/DNA雙重切割能力的CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng),成功獲得后代無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的抗ALS抑制劑類(lèi)除草劑水稻植株。該研究是在植物中首次成功利用RNA作為同源重組修復(fù)模板,開(kāi)辟了利用植物RNA作為同源供體模板進(jìn)行同源修復(fù)的新思路,是植物基因組編輯領(lǐng)域的重大進(jìn)展。相關(guān)研究論文“Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination”于2019年3月18日在線發(fā)表在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊《自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)》雜志上。
自2012年CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)被發(fā)明以來(lái),已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物和微生物等諸多物種的基因組編輯?;蚪M編輯首先在基因組靶向位置產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB),這些產(chǎn)生的DSB可通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)或者HDR途徑進(jìn)行修復(fù)。NHEJ最常用于移碼突變破壞基因功能,而HDR主要被用于對(duì)靶標(biāo)序列的精準(zhǔn)替換或定點(diǎn)插入。在多數(shù)物種中,NHEJ是DSB最主要的修復(fù)途徑,而通過(guò)HDR途徑進(jìn)行精準(zhǔn)修復(fù)的概率特別低。HDR修復(fù)途徑需要額外提供同源重組的供體作為修復(fù)的模板,在動(dòng)物中可以較容易地將CRISPR/Cas系統(tǒng)及同源重組供體遞送入細(xì)胞中,而在植物中,主要通過(guò)農(nóng)桿菌侵染或基因槍轟擊愈傷的方式來(lái)進(jìn)行CRISPR/Cas系統(tǒng)以及DNA供體的遞送。雖然利用基因槍轉(zhuǎn)化或者雙生病毒系統(tǒng)可以提高DNA模板數(shù)量提高HDR的發(fā)生概率,但是實(shí)現(xiàn)高效率的植物同源重組依然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn),限制了基因組編輯的拓展應(yīng)用。
研究人員首先利用分子生物學(xué)手段并對(duì)重組事件進(jìn)行評(píng)估,證實(shí)了將RNA作為同源重組修復(fù)模板,參與CRISPR/Cpf1介導(dǎo)的DNA同源重組修復(fù)的可行性。與通常使用的DNA模板不同,RNA模板可以在體內(nèi)通過(guò)植物自身的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)持續(xù)產(chǎn)生,為同源重組修復(fù)提供更多的模板。同時(shí),選擇具有RNA/DNA雙重切割能力的CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng),在細(xì)胞核內(nèi)同時(shí)加工產(chǎn)生用于靶向目標(biāo)序列的crRNA及一起轉(zhuǎn)錄的模板RNA,既產(chǎn)生了DSB又提供了同源重組修復(fù)的RNA模板,成功獲得OsALS兩個(gè)氨基酸定點(diǎn)替換成功的抗嘧啶羧酸類(lèi)除草劑水稻植株,且在子代分離得到了定點(diǎn)替換成功且無(wú)外源轉(zhuǎn)基因成分的植株。這項(xiàng)成果首次證明,除了通常使用的DNA模板,RNA同樣可作為植物同源重組修復(fù)的模板。在此研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化該策略的效率,有望解決目前植物同源重組頻率低下的難題,加速通過(guò)基因編輯技術(shù),精準(zhǔn)改良農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀,進(jìn)而定向創(chuàng)制農(nóng)作物新種質(zhì)的育種進(jìn)程。
作科所博士研究生李少雅為本文第一作者,作科所夏蘭琴研究員和美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校趙云德教授為本文的共同通訊作者。本研究得到轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重點(diǎn)項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、中國(guó)農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目和“農(nóng)科英才”領(lǐng)軍人才項(xiàng)目資助。