中國農(nóng)科院作物科學(xué)研究所作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)與應(yīng)用創(chuàng)新團隊與美國加州大學(xué)圣地亞哥分校合作,使用核糖核苷酸(RNA)作為同源重組修復(fù)(HDR)的模板,成功獲得后代無轉(zhuǎn)基因成分的抗ALS抑制劑類除草劑水稻植株。這是在植物中首次成功利用RNA作為脫氧核糖核酸(DNA)同源重組修復(fù)模板。相關(guān)研究論文北京時間3月19日凌晨在線發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊《自然生物技術(shù)》。
論文通訊作者、作科所研究員夏蘭琴介紹,CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)自2012年被發(fā)明以來,已被廣泛應(yīng)用于動物、植物和微生物等諸多物種的基因組編輯?;蚪M編輯技術(shù)中,首先是Cas核酸內(nèi)切酶在指導(dǎo)RNA引導(dǎo)下,在基因組特定位置進行切割,導(dǎo)致這些靶向位置的DNA雙鏈斷裂(DSB),此種DNA損傷可被細(xì)胞中的兩種修復(fù)途徑所修復(fù)。在多數(shù)物種中,非同源末端連接的修復(fù)途徑是DNA雙鏈斷裂最主要的修復(fù)途徑,而通過同源重組修復(fù)途徑(HDR)的概率特別低,無法高效將足量的修復(fù)模板(DRT)遞送到植物細(xì)胞。在植物中實現(xiàn)高效率的同源重組,并用于農(nóng)作物中優(yōu)異等位基因替換和重要農(nóng)藝性狀改良,還面臨巨大挑戰(zhàn)。
研究人員首先利用微滴數(shù)字PCR對重組事件進行評估,證實了RNA作為同源重組修復(fù)模板,參與CRISPR/Cpf1系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA同源重組修復(fù)的可行性。與通常使用的DNA修復(fù)模板不同,RNA修復(fù)模板可以在體內(nèi)通過植物自身的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)持續(xù)產(chǎn)生,為同源重組修復(fù)提供足夠的修復(fù)模板。研究人員又利用此方法,成功獲得OsALS兩個氨基酸定點替換成功的抗ALS抑制劑類除草劑水稻植株,且通過子代分離得到了定點替換成功且無外源轉(zhuǎn)基因成分的植株。
據(jù)悉,通常情況下,農(nóng)作物地方品種或近緣屬種中,含有大量優(yōu)異農(nóng)藝性狀等位基因。和常規(guī)栽培品種相比,這些優(yōu)異等位基因只存在單個堿基或者多個堿基差異。通過常規(guī)育種方法引入這些基因或優(yōu)異性狀,需要多年多代回交和雜交及材料選育,費時費力。通過CRISPR/Cas介導(dǎo)的同源重組技術(shù),可快速引入優(yōu)異等位基因,實現(xiàn)常規(guī)栽培品種相應(yīng)等位基因的精準(zhǔn)改良,進而加快定向創(chuàng)制農(nóng)作物新種質(zhì)的育種進程,對于農(nóng)作物育種改良具有重要意義。