近日,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物轉(zhuǎn)基因及基因編輯技術(shù)與應(yīng)用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種高效的植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng),成功精準(zhǔn)編輯了水稻的外源hptII突變基因和內(nèi)源OsEPSPS基因,獲得了精準(zhǔn)編輯純合和雜合植株,拓展了植物基因組精準(zhǔn)編輯工具。相關(guān)研究成果在線發(fā)表于《分子植物(Molecular Plant)》。
據(jù)夏蘭琴研究員介紹,近年來,CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)編輯、單堿基替換和同源重組體系的建立和利用,在農(nóng)作物基因功能研究和精準(zhǔn)育種中發(fā)揮了重要作用,展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。然而,CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)敲除技術(shù)只能在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)插入和刪除。由CRISPR/Cas系統(tǒng)衍生的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器,只能在基因組靶向位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C→T,G→A,A→G和T→C等4種單堿基轉(zhuǎn)換,還不能實(shí)現(xiàn)其它類型的堿基顛換。通過同源定向修復(fù)技術(shù),進(jìn)行基因組精確編輯,在植物中的效率依然非常低,只在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室可行。因此,迫切需要建立更高效的植物基因組精準(zhǔn)編輯技術(shù)體系。
此前,哈佛大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)通過將Cas9缺刻酶nCas9與逆轉(zhuǎn)錄酶突變體融合,在哺乳動物中開發(fā)了一系列新的基因組精準(zhǔn)編輯體系-引導(dǎo)編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠在不存在DNA雙鏈斷裂缺口和DNA供體修復(fù)模板的情況下,實(shí)現(xiàn)靶向插入、刪除和所有類型的單堿基自由轉(zhuǎn)換和顛換,為提高作物精確編輯效率提供了可能。
基于動物引導(dǎo)編輯系統(tǒng),該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步優(yōu)化該系統(tǒng),通過利用強(qiáng)啟動子分別啟動水稻密碼子優(yōu)化的nCas9-逆轉(zhuǎn)錄酶融合基因和引導(dǎo)編輯向?qū)NA(pegRNA)與小向?qū)NA(sgRNA)串聯(lián)體的共表達(dá),采用體內(nèi)可自我剪切的tRNA間隔pegRNA和sgRNA,并分別在豌豆Rubisco小亞基E9終止子和Nos終止子前面,添加了增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性的多聚腺苷酸(PolyA),構(gòu)建了高效植物引導(dǎo)編輯器。研究人員利用上述植物引導(dǎo)編輯器,通過基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,分別對靶向水稻外源hptII突變基因和內(nèi)源OsEPSPS基因進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯,成功獲得了15株hptII精準(zhǔn)修飾純合植株和1株OsEPSPS基因精準(zhǔn)修飾雜合植株,精確編輯效率分別為9.38%和2.22%。高效植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的建立,為水稻以及其他作物基因組精確編輯提供了有效工具,有望加快農(nóng)作物定向遺傳改良的進(jìn)程。
該研究得到轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)和中國農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程與“農(nóng)科英才”特支計(jì)劃項(xiàng)目資助。(通訊員 衛(wèi)斐)
原文鏈接:https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.03.011